① 引物長度

一般引物長度為18~30堿基與時俱進≌{解製度？偟恼f來穩定，決定引物退火溫度（Tm值）重要的因素就是引物的長度管理。有以下公式可以用于粗略計算引物的退火溫度最新。

在引物長度小于20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物長度大于20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟件也可以對退火溫度進行計算責任，其計算原理會各有不同有所增加，因此有時計算出的數(shù)值可能會有少量差距姿勢。為了優(yōu)化PCR反應敢於挑戰，使用確保退火溫度不低于54℃的短的引物可獲得好的效率和特異性不斷創新。

總的說來，每增加一個核苷酸引物特異性提高4倍提供了遵循，這樣參與水平，大多數(shù)應用的短引物長度為18個核苷酸。引物長度的上限并不很重要服務效率，主要與反應效率有關明確相關要求。由于熵的原因，引物越長統籌發展，它退火結合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小深化涉外。

② GC含量

一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對引物的GC含量和Tm值應該協(xié)調生產製造。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A開展試點、T或G、C尾巴共同。

③ 退火溫度

退火溫度需要比解鏈溫度低5℃推進一步，如果引物堿基數(shù)較少經過，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加力度；如果堿基數(shù)較多明確了方向，那么可以適當減低退火溫度，是DNA雙鏈結合勇探新路。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響PCR的產率單產提升，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化試驗。 ④ 避免擴增模板的二級結構區(qū)域

選擇擴增片段時好避開模板的二級結構區(qū)域勞動精神。用有關計算機軟件可以預測估計目的片段的穩(wěn)定二級結構，有助于選擇模板切實把製度。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol時自行開發，擴增往往不能成功銘記囑托。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的自動化裝置。

⑤ 與靶DNA的錯配

當被擴增的靶DNA序列較大的時候示範，一個引物就有可能與靶DNA的多個地方結合，造成結果中有多個條帶出現(xiàn)有很大提升空間。這個時候有必要先使用BLAST軟件進行檢測運行好，