① 引物長度

一般引物長度為18~30堿基哪些領域?？偟恼f來發力，決定引物退火溫度（Tm值）重要的因素就是引物的長度過程中。有以下公式可以用于粗略計算引物的退火溫度。

在引物長度小于20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物長度大于20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟件也可以對退火溫度進行計算首要任務，其計算原理會各有不同管理，因此有時計算出的數(shù)值可能會有少量差距。為了優(yōu)化PCR反應(yīng)深入實施，使用確保退火溫度不低于54℃的短的引物可獲得好的效率和特異性應用提升。

總的說來，每增加一個核苷酸引物特異性提高4倍業務指導，這樣新品技，大多數(shù)應(yīng)用的短引物長度為18個核苷酸。引物長度的上限并不很重要創造性，主要與反應(yīng)效率有關(guān)保持穩定。由于熵的原因，引物越長能力，它退火結(jié)合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。

② GC含量

一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%創造更多，一對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A好宣講、T或G、C尾巴保障性。

③ 退火溫度

退火溫度需要比解鏈溫度低5℃不斷進步，如果引物堿基數(shù)較少，可以適當提高退火溫度領先水平，這樣可以使PCR的特異性增加認為；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當減低退火溫度效率，是DNA雙鏈結(jié)合良好。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的建言直達，可以在55℃～75℃間變化大幅拓展。 ④ 避免擴增模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域

選擇擴增片段時好避開模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機軟件可以預(yù)測估計目的片段的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)大部分，有助于選擇模板重要工具。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol時更加堅強，擴增往往不能成功提供有力支撐。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的配套設備。

⑤ 與靶DNA的錯配

當被擴增的靶DNA序列較大的時候發展成就，一個引物就有可能與靶DNA的多個地方結(jié)合，造成結(jié)果中有多個條帶出現(xiàn)建議。這個時候有必要先使用BLAST軟件進行檢測優勢，