流式細胞儀技術(shù)，主要是測量群體中單個細胞經(jīng)適當染色后其成分所發(fā)出的散射光和熒光簡單化，經(jīng)染色的細胞在懸液中以單行流過高強度光源的焦點合規意識，當每個細胞經(jīng)過焦點時促進進步，發(fā)出一束散射光/或熒光貢獻法治。它們經(jīng)過過濾及光鏡系統(tǒng)收集到達一個光電檢測器(光電倍增管或一個固態(tài)裝置)基礎，光檢測器把散射光定量轉(zhuǎn)化成電信號提供堅實支撐，經(jīng)數(shù)字轉(zhuǎn)換器進行數(shù)字化后而成整數(shù)結構，然后進行電子存儲，以后數(shù)據(jù)可以調(diào)出顯示和進行分析資源配置。其優(yōu)點如下：
1信息、具有操作簡便，只要將染色的單個細胞推入儀器中大力發展，就會得出數(shù)據(jù)豐富內涵。
2、具有較高的靈敏度及測定速度產能提升，而且每次可測出許多數(shù)據(jù)適應性，一般情況下，每秒可測5000個細胞總之，能迅速分析和記數(shù)大量細胞面向，并能準確統(tǒng)計群體中熒光標記細胞的比例。
3研學體驗、應(yīng)用廣泛，即可用于測定細胞活力最為突出、繁殖周期和細胞定型分析落實落細，也可區(qū)別死亡細胞自動化、分裂細胞和靜止細胞群，既可測定DNA和RNA高品質、測凋亡峰不折不扣，又可測蛋白含量，特別是胞漿蛋白資源優勢。
一高效利用、樣品的制備
流式細胞儀是測定一個或重復(fù)的每個顆粒經(jīng)光路的信號，因此估算，細胞必須做成單個細胞懸浮狀態(tài)講理論，不能聚集，也不允許有細胞碎片存在不要畏懼。所用染料必須特異(如特異單抗)服務為一體，而且不允許滲透至載液中。
標本如果是屬于淋巴細胞等血細胞逐漸顯現、骨髓細胞或白血病細胞系或類淋巴細胞系全會精神，要經(jīng)Ficoll分離，作單細胞分離處理拓展基地，但若為實體組織或貼壁生長的上皮成纖維樣細胞集中展示，需采用酶消化法(胰蛋白酶、膠原酶等)體系流動性，化學法(EDTA探索創新、EGTA和檸檬酸鹽)消化分散液或洗液用無鈣、鎂PBS積極拓展新的領域，檸檬酸鹽的濃度為40μmol/L配套設備，并同時采用機械分散法，將經(jīng)消化處理的膨松組織相對開放，用玻璃珠懸搖或用吸管吹打分散均可推進高水平，用PBS洗2～3次后重懸，過一下尼龍或不銹鋼網(wǎng)篩100μm和20μm拓展應用。細胞濃度要保證在1～2×106/ml生產創效。
若標本用于測定單個細胞，需加入1～5mg/L的DNAase管理，將有助于阻止破碎細胞釋放的DNA造成細胞再聚集優化上下，但是若分離的細胞要作DNA含量測定之用時，則切勿加DNAase模樣。
二事關全面、懸浮細胞的固定
上述制備的活細胞即可用于流式細胞儀分析，如果染色和流式分析要拖后進行狀態，或為了提高染色效果技術節能，則要將細胞預(yù)固定指導。乙醇固定是常用的方法。
1國際要求、固定方法：
(1)甲醛法：在細胞懸液中加入等量的8%甲醛(用Hank’S液配)4℃下固定12～18小時流動性。
(2)乙醇法：細胞懸于PBS中，緩慢加入-20℃預(yù)冷的95%乙醇競爭激烈，使終濃度為70%持續創新，冰浴30分鐘。
(3)丙酮法：于細胞懸液中空白區，緩慢加入冷丙酮協調機製，使終濃度為85%。
2充分發揮、實例：
(1)用預(yù)冷的無鈣高質量、鎂含0.5mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液，將細胞制成1×106細胞的懸液選擇適用。
(2)在4℃下逐滴加入3倍體積的95%乙醇管理，連續(xù)攪拌使乙醇終濃度達70%。
(3)該細胞可在4℃下保存數(shù)日業務指導。
(4)分析前先用1000r/min離心10分鐘改進措施，棄去乙醇，再將細胞懸于PBS中或要求的試劑中長足發展。
三今年、流式細胞儀分析的應(yīng)用
(一)非染色細胞的光散射
一個粒子(如細胞)出現(xiàn)在一束光線中，立即會干擾該光束結構不合理，造成該光束入射光的重分布動手能力，該細胞所獲能量則以衍散、折射意見征詢、反射等復(fù)雜的參數(shù)形式重新發(fā)射出來提升，這些參數(shù)與細胞體積、表面構(gòu)象的必然要求、內(nèi)部結(jié)構(gòu)形成函數(shù)關(guān)系研究成果，可測低角前面約10°的光散射及90°的光散射。
一般認為應用擴展，90°位置的光散射值主要受細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)所致的光反射和折射影響體驗區，而低角前面10°位置的光散射則主要代表細胞大小。光散射測量方法如下：
(1)將細胞懸浮于HBSS中活動上，濃度介于1×106～2×106/ml濃度之間有望。
(2)以懸浮細胞平衡鹽溶液(HBSS)充滿含鞘液的細胞貯藏池。
(3)設(shè)定細胞流量為500個/S(秒)，以獲得*測定結(jié)果標準。
(二)染色法
1示範推廣、細胞的碘化丙錠(propiolium iodide堅持好，PI)染色
PI和EB(溴化乙錠)為同類物質(zhì)即將展開，與EB一樣，PI嵌入DNA雙螺旋中特性，可使熒光強度增加約20倍傳承，PI的熒光強度約為EB染色的1.8倍，以488nm波長激發(fā)建言直達，DNA/PI復(fù)合物zui大的發(fā)射波長約為615nm多種。
1.1 小鼠Lewis肺癌細胞(3LL)DNA含量測定方法
(1)從C57BL/6小鼠上切除腫塊，在培養(yǎng)皿內(nèi)用PBS沖洗;
(2)去除結(jié)締組織及脂肪充分發揮，剪碎腫塊;
(3)小碎片移入1.20×38mm注射針發展成就，加壓使其通過，于4℃條件下重懸細胞于HBSS中重要方式。
(4)將200～300μL細胞懸液(5×105細胞/ml)中加入3ml PI(50μg/ml)開展面對面，染色3LL細胞，于4℃存放20～30分鐘非常重要。
(5)測定580～750nm之間的發(fā)射熒光進一步提升，以去除末結(jié)合PI產(chǎn)生的激發(fā)光與發(fā)射光譜線之間的重疊部分。
注：PI染色液：0.1%檸檬酸鈉1000ml+PI5mg+1%Nonide P40水營造一處。
1.2 培養(yǎng)細胞DNA的流式細胞儀分析
(1)從培養(yǎng)皿中吸去培養(yǎng)基改革創新，以HBSS沖洗二次;
(2)加入PI5ml于培養(yǎng)皿中，在4℃放10分鐘;
(3)用吸管反復(fù)次打細胞取得顯著成效，使細胞破壞新模式，胞核釋放出來，再行流式細胞儀分析不容忽視。
1.3 完整細胞DNA的PI染色
(1)70%乙醇固定的細胞懸液組織了，離心，去固定液;
(2)室溫條件下加入PI染色一批細胞(105～106細胞/ml)基礎上，時間為30分鐘各領域，然后行流式細胞儀分析。
1.4 光輝霉素和PI的DNA染色
在熒光抗生素光輝霉素和PI聯(lián)合染色過程中保持競爭優勢，光輝霉素的供體分子被PI的受體分子接受產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移進行培訓，該染色技術(shù)主要用于實體腫瘤組織，精子細胞及婦科標本長效機製，同時也適用于體外培養(yǎng)的細胞法治力量。
(1)分離制備的細胞懸液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。
(2)以PI/光輝霉素染色共享，4℃1小時(PI為10mg/L信息化、光輝霉素為10mg/L)。
(3)染色后進樣生動，以100W汞燈作為激光光源新型儲能，使用BG123nm阻斷濾片，疊加K590型高通濾法(one seep filter)新品技。
2範圍、DNA和RNA的鑒別染色
利用吖啶橙的變色特性可鑒別DNA和RNA。吖啶橙作為一種熒光染料已被用于染色固定紮實做，非固定細胞核酸空間廣闊，或作溶酶體的一種標記。觀察死亡細胞熒光變色性變化以及區(qū)別分裂細胞和靜止細胞群體提供深度撮合服務。雖然測定DNA和RNA含量時較難獲得好的重復(fù)性結(jié)果服務品質，但該方法已被許多實驗室廣泛采用。方法如下：
(1)試劑：
溶液A：低溫保存組成部分，穩(wěn)定期約2周影響。
Triton X-100(0.1%0.1ml，1mol/LHCL 8ml
1mol/LNaCI15ml蒸餾水76ml技術節能，PH1.5(100ml)
溶液B：穩(wěn)定期數(shù)月指導，除菌以后(高壓或過濾)貯存。
0.01mol/LEDTA10ml國際要求，1mol/LNaCI15ml
0.4mol/LNa2HPO4 31.5ml流動性，0.2mol/L檸檬酸18.5ml
蒸餾水24ml，總體積為99ml競爭激烈，pH6.0
吖啶橙母液：
用吖啶橙/蒸餾水配成1mg/mL(致癌物具體而言，應(yīng)小心)，吖啶橙應(yīng)用液0.1ml母液加9.9ml溶液B稀釋智慧與合力。
注意：儀器鞘流系統(tǒng)應(yīng)保持4℃喜愛。
氬激光激發(fā)波488nm，紅色熒光為DNA(F>600nm)開放要求，綠色熒光為RNA或單鏈DNA(F>530nm)
(2)方法
①用含15%血清的PBS配制細胞懸液向好態勢，取0.2ml(8×106細胞/ml)，加入0.4ml溶液A服務機製，4℃放置45～60秒貢獻力量。
②加1.2ml含吖啶橙的溶液B，室溫2分鐘大幅拓展。
③應(yīng)在加入溶液B后10分鐘內(nèi)進流式細胞儀分析發行速度。
注意：①細胞數(shù)保持恒定;②核酸與吖啶橙的比例;③染色時間及溫度。
(三)染色法的應(yīng)用
1、變性及雙鏈DNA的鑒別染色
(1)試劑：
HBSS內(nèi)含1000u/ml RNA酶A性能，0.2mol/LKCl初步建立，pH1.35
吖啶橙用0.1mol/L檸檬酸配成5mg/L(16.7μm)，0.2mol/L Na2HPO4 緩沖液供給，pH2.6的方法。
①2×106細胞懸于1mlHBSS/RNase液中。
②37℃溫育1小時重要的意義。
③將0.2ml細胞懸液(含4×105細胞始終懸浮于HBSS/RNase)與0.5ml0.2mol/L KCl(pH1.35)混勻持續，20℃ 30分鐘。
④加2ml吖啶橙染色2分鐘再獲。
⑤綠色熒光(530nm)和紅色熒光(600nm)分別代表細胞中單鏈及雙鏈DNA含量。
2應用擴展、DNA與癌基因探針雙標記測定
這種測定是先用癌基因探針按間接免疫熒光染色法標記癌基因表達產(chǎn)物體驗區，然后用PI標記DNA，現(xiàn)以研究白血病細胞增殖與癌基因的關(guān)系說明操作步驟：
(1)制備白血病細胞懸液活動上，用100%甲醇在-20℃固定10分鐘有望。
(2)取50μl50mg/L的癌基因探針Y13-25(它是一種廣譜單克隆抗體，可特異性地直接與N-ras導向作用，Ki-ras和Ha-ras三種癌基因編碼的21Kd蛋白相結(jié)合)方案，4℃作用30～45分鐘。
(3)用PB離心洗滌2次真正做到，重懸浮于50μlHBSS中(含0.1%疊氮鈉和2%小牛血清)科普活動。
(4)加入50μl1：200兔抗鼠IgG，4℃放置30～45分鐘強化意識。
(5)同(3)洗滌后加入50μl1：40的FITC標記的羊抗兔IgG長期間，4℃反應(yīng)30～45分鐘。
(6)同(3)洗滌后現場，細胞用RNA酶消化高端化，室溫20～30分鐘。
(7)同(3)洗滌后我有所應，用PI染液染20分鐘提單產。
(8)同(3)洗滌后，用488nm激發(fā)波長測定至關重要。FITC染色顯示ras癌基因表達產(chǎn)物發展空間，PI染色顯示DNA含量。
注意事項：
①制備樣品時無障礙，離心次數(shù)不宜過多連日來，防止細胞丟失和凝集;
②細胞固定時間不宜過長，不要用冰醋酸、乙醇系統、苦咪酸及汞固定劑;
③為了降低本底增強，應(yīng)將細胞表面未結(jié)合的熒光染料洗凈;
④進行雙標記沉淀時，應(yīng)盡量選用激發(fā)光譜不接近的熒光色素交流等。
3更加廣闊、以溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料進行細胞周期分析
(1)試劑：
用培養(yǎng)基配制33mg/LBrdu及脫氧細胞苷26.4g/ml。
染色液：Hoechst33258溶于PBS提高，細胞染色24小時后進行分析可以使用，據(jù)報道染色的穩(wěn)定時間在30分鐘至24小時之間。
(2)方法：
①將Brdu溶液按1：10加入細胞培養(yǎng)液中紮實。
②根據(jù)細胞周期時間不同效高化，選擇不同時間培養(yǎng)的細胞。
③孵育后投入力度，搖散細胞以傳代培養(yǎng)創造。
④直接用染液重懸細胞，進入流式細胞儀分析貢獻法治。
Hoechst33258熒光值在410～580nm之間設備製造，需用330～360nm紫外光激發(fā)。應(yīng)特異性結(jié)合腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對高質量。因此相對簡便，不僅特異性標記DNA，亦可標記胸腺嘧啶流程。在細胞周期分析時合作，在與細胞孵育過程加入Brdu，Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶上高質量，因此一站式服務，處于合成期內(nèi)的細胞表面上仍保持二倍體狀態(tài)，并在分裂后G1峰的半峰處產(chǎn)生一新峰深入交流，此項技術(shù)可用于直接測定細胞G2期及分裂時間引領作用。
4、Hoechst33342染色活細胞DNA
(1)試劑：Hoechst 33342臺上與臺下，用蒸餾水配成0.25mol/L用的舒心。
(2)方法：
①制備106/ml細胞懸液，以Hoechst33342染色集聚效應，濃度為5～10mg/L 集成，室溫下20分鐘。
②分析前切勿洗滌細胞互動講。
Hoechst33342可用作細胞DNA的活體染料穩定性，據(jù)信可在保持細胞活性的同時像一棵樹，呈現(xiàn)出相當好的DNA化學計量關(guān)系，激發(fā)波在紫外范圍350～363nm之間去突破，發(fā)射波則在450nm處能運用。
5、以異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyante FIFC)染色蛋白質(zhì)智能設備。
(1)試劑：異硫氰酸熒光素(FIFC)用含40mg/LRNase的PBS配成0.1～1.0mg/L濃度不可缺少。
(2)方法：
①染色前用終濃度70%乙醇固定細胞，至少18小時特點。
②離心固定細胞積極回應，棄去固定液。
③室溫下用FIFC染色細胞蛋白又進了一步，30分鐘多種場景。
④流式細胞儀分析，使用氬激光貢獻力量，激發(fā)波長488nm重要的作用，熒光發(fā)射波長515～535nm。
也可于固定細胞中去創新，以18mg/L(0.1%檸檬酸鹽配制)和0.05mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分鐘以上可對DNA和蛋白質(zhì)雙重染色緊迫性，分別呈現(xiàn)紅色熒光(DNA)和綠色熒光(蛋白質(zhì))結構。
6、熒光素抗體的應(yīng)用
該技術(shù)既可用于檢測帶有特異性膜抗原的細胞高效，可用熒光素或若丹明標記單克隆抗體處理上述細胞;也可用于測定胞漿中的蛋白質(zhì)(如凋亡BCL-2蛋白溝通協調，抗病毒蛋白MXA等)。
用磷酸鹽緩沖液Eagle’s MEM稀釋FIFC連接的抗體內(nèi)含0.1%疊氮鈉體系、2%牛血清保障性。為判定FIFC抗體的zui適度的稀釋濃度，向微量滴定板的細胞中加入50μl不同濃度的稀釋液責任製，再以熒光顯微鏡確認*染色濃度十分落實。使用抗人LEU-I抗體分析時，應(yīng)稀釋成5mg/L或0.25mg/L規則製定。無論鼠或人細胞在2×107濃度時其存活率應(yīng)在90%以上製造業。
方法：
(1)于微量滴定板加入50μl抗體稀釋度，再加入50μl細胞懸液關規定，混勻發展基礎。
(2)冰浴45分鐘，離心滴定板(1500r/min10分鐘)建強保護。
(3)棄上清同期，以培養(yǎng)基100μl洗滌細胞沉淀2次生產效率，每次洗滌后用1500r/min10分鐘，棄上清效果。
(4)以1ml預(yù)冷的培養(yǎng)基配成1×106細胞/ml的已染色細胞懸液使用，進樣前持續(xù)保持冷環(huán)境(4℃)。
目前流式細胞儀(FCM)已在各學科中獲得應(yīng)用長期間。
①細胞生物學：定量分析細胞周期并分選不同細胞周期時相的細胞;分析生物大分子如DNA基本情況、RNA、抗原高端化、癌基因表達產(chǎn)物等物質(zhì)與細胞增殖周期的關(guān)系力量，進行染色體核型分析，并可純化X或Y染色體不負眾望。
②腫瘤學：DNA倍體含量測定是鑒別良高效流通、惡性腫瘤的特異指標。近年來已應(yīng)用DNA倍體測定技術(shù)精準調控，對白血病功能、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌解決、前列腺癌等多種實體瘤細胞進行探測預期。用單克降抗體技術(shù)清除血液中的腫瘤細胞。
③免疫學：研究細胞周期或DNA倍體與細胞表面受體及抗原表達的關(guān)系;進行免疫活性細胞的分型與純化;分析淋巴細胞亞群與疾病的關(guān)系;免疫缺陷病如艾滋病的診斷;器官移植后的免疫學監(jiān)測等幅度。
④血液學：血液細胞的分類結構、分型，造血細胞分化的研究貢獻，血細胞中各種酶的定量分析規模最大，如過氧化物酶、非特異性酯酶等;用NBT及DNA雙染色法可研究白血病細胞分化成熟與細胞增殖周期變化的關(guān)系統籌，檢測母體血液中Rh(+)或抗D抗原陽性細胞最深厚的底氣，以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發(fā)生嚴重溶血;檢測血液中循環(huán)免疫復(fù)合物可以診斷自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡等振奮起來。
⑤藥物學：檢測藥物在細胞中的分布品質，研究藥的作用機制，亦可用于篩選新藥等地，如化療藥物對腫瘤的凋亡機制最為顯著，可通過測DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等規定。