細(xì)胞凋亡的檢測方法眾多成效與經驗，流式細(xì)胞儀檢測凋亡節點，是常用的方法。由于流式細(xì)胞儀固有的特點(diǎn)――可以準(zhǔn)確的進(jìn)行凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)。因此慢體驗，具有其它方法*的*性長效機製。下面我們就簡單明了地介紹流式在檢測凋亡方面的應(yīng)用實踐者。
在凋亡誘導(dǎo)劑的作用下，首先是細(xì)胞色素C和apa f-1形成復(fù)合體，線粒體的功能發(fā)生衰退;后是caspase家族激活大幅增加，磷脂酰絲氨酸外翻特性，這時(shí)細(xì)胞的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生了改變，可以看到細(xì)胞變小等特點，胞核皺縮;zui后是細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂建言直達，形成凋亡小體。
在凋亡發(fā)生的各個(gè)過程當(dāng)中將進一步，都有相應(yīng)的流式細(xì)胞儀的檢測方法充分發揮，可以采用以下檢測方法：
1、線粒體功能
2成就、DNA Cycle
3能力建設、Caspases
4、Annexin V Assay
5研究進展、DNA Fragmentation Assays
基本上涵蓋了細(xì)胞凋亡的各個(gè)期設計標準，對各種檢測方法的原理和特點(diǎn)做一個(gè)簡單介紹。
線粒體功能檢測的試劑盒有深圳達(dá)科為公司代理的試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)為BVK250)和BD公司出售的盒Apo-Alert試劑盒互動互補。其檢測主要采用陽離子型熒光染料。原理是：正常細(xì)胞中意向，染料可以在線粒體內(nèi)聚集意料之外，發(fā)出明亮的紅色熒光;而細(xì)胞凋亡后，其線粒體膜電位發(fā)生改變形式，染料無法進(jìn)入線粒體置之不顧，只能在胞質(zhì)中以單體形式存在，發(fā)出綠色的熒光數字化》奖?？梢栽跓晒怙@微鏡下基礎上，或流式檢測。采用488nm激發(fā)應用領域，其檢測波長分別是527nm和590nm保持競爭優勢。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程操作簡單，只需要30min就可以見到結(jié)果發展機遇。
Caspase家族可以檢測的分子非常多長效機製，也有不少商業(yè)的試劑盒可以應(yīng)用。即使沒有相應(yīng)的試劑盒全技術方案，只要有相應(yīng)抗體基本上是可以檢測的分享，具體的方法是參照細(xì)胞內(nèi)蛋白檢測的步驟。
在細(xì)胞凋亡過程中伴隨著一系列的形態(tài)特征改變信息化，細(xì)胞膜的改變是這些特征中較早出現(xiàn)的一種方式之一。在凋亡細(xì)胞中，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外側(cè)新型儲能。Annexin-V是一種35-36 KD的鈣粒子依賴的磷脂結(jié)合蛋白創新能力，它對PS具有較高的親和力。細(xì)胞凋亡時(shí)領域，可以和外翻的PS結(jié)合溝通機製，從而可以檢測凋亡的細(xì)胞。發(fā)生死亡的細(xì)胞其細(xì)胞膜上的PS也外翻註入新的動力，因而也會(huì)陽性顯示。因此，常用的凋亡試劑盒除了采用Annexin-V標(biāo)記之外效率和安，還會(huì)加一種DNA染料設計能力，常用的有PI和7-AAD，由于死亡的細(xì)胞膜通透性增高深入開展，染料可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和DNA結(jié)合更為一致，從而可以發(fā)熒光，區(qū)分出死細(xì)胞技術的開發。
下圖給出的是在使用FAS單抗誘導(dǎo)前后的檢測結(jié)果研究與應用，橫坐標(biāo)是Annexin-V FITC, 縱坐標(biāo)是PI，左上更高效、右上全面協議、左下、右下四個(gè)象限中右上象限代表死亡的細(xì)胞具體而言，左下象限是存活的細(xì)胞工具，右下象限是凋亡的細(xì)胞。
在采用Annixin V方法檢測凋亡細(xì)胞時(shí)喜愛，要特別強(qiáng)調(diào)一點(diǎn)：該方法適用于懸浮生長的細(xì)胞重要的角色，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測開放要求。對于貼壁生長的細(xì)胞，由于在胰酶等消化處理過程中會(huì)造成細(xì)胞膜的損傷平臺建設，會(huì)造成較高的假陽性服務機製，從而影響檢測結(jié)果。盡管目前推動並實現，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細(xì)胞薄弱點。我不推薦用該方法檢測。因?yàn)槠渲貜?fù)性較差優化程度，且需要操作時(shí)非常小心積極性。
DNA周期檢測原本是用來反應(yīng)細(xì)胞各個(gè)期，即細(xì)胞增殖狀況的不斷豐富。利用細(xì)胞內(nèi)DNA能夠和熒光染料實施體系，如PI結(jié)合的特性。細(xì)胞各個(gè)時(shí)期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同各有優勢，流式檢測的熒光輕度也不一樣效果較好。G2-M期DNA含量是G0-G1的兩倍，而S期介于兩者之間核心技術體系。
但是由于發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞DNA含量較少開拓創新，因而可以在細(xì)胞G0-G1期前面有一個(gè)亞二倍體峰，從而認(rèn)為是凋亡細(xì)胞必然趨勢。但是由于死亡的細(xì)胞本身其DNA含量也是減少的促進善治，因而非常難于區(qū)分凋亡和死亡的細(xì)胞。在90年代多樣性，該方法曾經(jīng)風(fēng)靡一時(shí)發揮效力，現(xiàn)在看來，那時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要推敲明顯。盡管安全鏈，經(jīng)典的流式檢測資料給出的圖是認(rèn)為凋亡的細(xì)胞是緊挨著G0-G1期峰的一個(gè)峰，死亡的細(xì)胞峰離G0-G1期峰較遠(yuǎn)創新為先，但是這種典型的結(jié)果似乎很難獲得真正做到。有其它的替代方法，*可以不用這種方法創新延展。
晚期凋亡的細(xì)胞由于DNA的斷裂強化意識，因而可以出現(xiàn)DNA ladder，從而也就有了經(jīng)典的檢測方法TUNEl進展情況。流式也能進(jìn)行Tunel檢測，其檢測原理與經(jīng)典Tunel原理基本一致綠色化發展。以BD公司的為例至關重要，其利用TdT能將熒光素標(biāo)記的dUTP標(biāo)記到斷裂的DNA末端不久前，從而使凋亡的細(xì)胞具有熒光。但是由于在細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記提升行動，細(xì)胞需要進(jìn)行固定處理能力建設，操作類似免疫組織化學(xué)法，容易造成假陽性研究進展。建議采用原裝大廠的試劑盒無障礙，并且嚴(yán)格的設(shè)立對照。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定后再進(jìn)行大規(guī)模實(shí)驗(yàn)快速融入。標(biāo)本處理后認為，均可以用熒光纖維鏡進(jìn)行觀察，拍照增強。流式檢測后重要意義，可以進(jìn)行的計(jì)算凋亡百分比。這一點(diǎn)更優美，經(jīng)典TUNEl是做不到的各方面。