三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是一種通過構(gòu)建三維空間結(jié)構(gòu)更加廣闊，模擬細(xì)胞在體內(nèi)自然微環(huán)境的體外培養(yǎng)技術(shù)引領，旨在彌補(bǔ)傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)間的差距去完善，為細(xì)胞提供更接近生理狀態(tài)的生長(zhǎng)條件。該系統(tǒng)核心在于通過支架材料或無支架技術(shù)構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)特征更加明顯。支架材料包括天然的膠原、Matrigel及合成材料如聚乳酸講理論、聚苯乙烯等的可能性，它們通過調(diào)整孔隙率、力學(xué)性能支持細(xì)胞黏附服務為一體、遷移及功能表達(dá)問題。無支架技術(shù)則包括懸滴法、磁力懸浮等要落實好，利用重力或磁場(chǎng)使細(xì)胞聚集成球緊密相關。

　　三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)有多種類型，常見的包括基于基質(zhì)膠、細(xì)胞外基質(zhì)支架培訓、微流控芯片以及旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)等不合理波動，不同系統(tǒng)操作方法有所差異。以下是一些常見三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的操作指南：

　　1重要工具、基于基質(zhì)膠的三維細(xì)胞培養(yǎng)

　　實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備基質(zhì)膠積極拓展新的領域、適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基、細(xì)胞更優質、24孔板或6孔板等實(shí)驗(yàn)耗材相對開放。

　　基質(zhì)膠預(yù)處理：將基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱過夜融化脫穎而出。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求拓展應用，按一定比例與培養(yǎng)基混合稀釋，如1:10結構。將稀釋后的基質(zhì)膠均勻鋪在培養(yǎng)板孔中管理，每孔約200-300μL，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使其覆蓋孔底能力建設，再將培養(yǎng)板放入37℃戰略布局、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，使基質(zhì)膠形成凝膠狀基底表現明顯更佳。

　　細(xì)胞接種與培養(yǎng)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化下來狀態，用含血清培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)指導，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整細(xì)胞密度廣泛認同，一般建議在5×10?-1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液均勻接種到鋪好基質(zhì)膠的培養(yǎng)孔中增持能力，每孔約200-300μL共同努力，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻分布，然后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)追求卓越，定期更換培養(yǎng)基逐漸完善。

　　實(shí)驗(yàn)觀察與分析：通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，記錄生長(zhǎng)合理需求、增殖情況是目前主流。還可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捎肕TT實(shí)驗(yàn)高質量、劃痕實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行檢測(cè)充分發揮，最后對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

　　2管理、基于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和Transwell系統(tǒng)的三維細(xì)胞培養(yǎng)

　　材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備Matrigel或其他ECM設計、預(yù)冷無菌1.5ml離心管、Transwell插入（24孔或12孔，根據(jù)細(xì)胞大小選擇孔徑）就此掀開、適配多孔板長足發展、細(xì)胞系或類器官模型、培養(yǎng)基穩步前行、無菌移液器與槍頭結構不合理、無菌PBS緩沖液等。

　　ECM預(yù)處理：將ECM懸浮液從冰箱取出保持在冰上逐步改善，用預(yù)冷移液器移取適量分裝到離心管中意見征詢。然后將少量ECM加入到Transwell系統(tǒng)的下腔室底部，涂布均勻大大提高，放入37℃溫箱孵育30分鐘使其固化的必然要求。

　　細(xì)胞或類器官懸液制備：胰酶消化細(xì)胞后重懸于培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度至1-5×10?cells/ml產品和服務。若為類器官提供了有力支撐，先用ECM包被，再輕輕重懸至ECM中并調(diào)整濃度前景。

　　Transwell插入預(yù)處理：在每個(gè)Transwell插入的內(nèi)腔中加入50-100μl的ECM，確保覆蓋孔膜表面增幅最大，孵育30分鐘至固化共享應用。

　　細(xì)胞或類器官接種：將細(xì)胞懸液或類器官懸液滴加到Transwell插入的內(nèi)腔中，然后向上腔室和下腔室加入合適的培養(yǎng)基標準，注意避免氣泡產(chǎn)生示範推廣。

　　培養(yǎng)與維護(hù)：將多孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即將展開，每隔2-3天更換上腔室和下腔室的培養(yǎng)基大幅增加，更換時(shí)小心吸除舊培養(yǎng)基，避免擾動(dòng)細(xì)胞或類器官傳承。

　　分析與記錄：定期用顯微鏡觀察生長(zhǎng)情況等特點，記錄圖像和形態(tài)學(xué)變化。還可根據(jù)需求收集細(xì)胞或類器官多種，用于免疫熒光將進一步、qPCR等功能分析，同時(shí)記錄培養(yǎng)情況和相關(guān)數(shù)據(jù)發展成就。

　　3成就、微重力3D旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

　　系統(tǒng)安裝：將回旋主機(jī)放置在培養(yǎng)箱內(nèi)，確保旋轉(zhuǎn)座與培養(yǎng)箱內(nèi)壁至少保留10cm間隙開展面對面。使用配套扁平電纜連接控制器與主機(jī)系統，注意接口防塵。接入220V交流電。

　　參數(shù)設(shè)置：通過控制器觸屏選擇重力模式空間廣闊，如微重力（1-4rpm）或超重力（2-5g）營造一處，還可設(shè)置定時(shí)啟動(dòng)、旋轉(zhuǎn)速度梯度變化等程序支撐能力。

　　培養(yǎng)容器準(zhǔn)備：若為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)資源優勢，可使用T25培養(yǎng)瓶或轉(zhuǎn)壁式EP管反應(yīng)器，注意培養(yǎng)基充注量特征更加明顯。進(jìn)行3D球體培養(yǎng)時(shí)估算，優(yōu)化細(xì)胞密度，如5×10³-1×10?cells/mL方便，添加低血清培養(yǎng)基基礎上。

　　系統(tǒng)啟動(dòng)與監(jiān)測(cè)：?jiǎn)?dòng)系統(tǒng)后，通過重力傳感器查看X/Y/Z軸重力數(shù)值應用領域，確保實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定保持競爭優勢。系統(tǒng)支持37°C、5%CO?培養(yǎng)箱環(huán)境發展機遇，需提前校準(zhǔn)溫濕度參數(shù)長效機製。

　　注意事項(xiàng)：控制器需遠(yuǎn)離強(qiáng)磁場(chǎng)環(huán)境，啟動(dòng)前確認(rèn)旋轉(zhuǎn)框無阻擋全技術方案。定期用75%酒精擦拭旋轉(zhuǎn)座表面分享，防止污染，且定期對(duì)重力傳感器校準(zhǔn)信息化。

　　4方式之一、基于水凝膠的三維細(xì)胞培養(yǎng)（以CulXⅡ型為例）

　　材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備CulXⅡ型水凝膠凍干粉、細(xì)胞培養(yǎng)基新型儲能、待培養(yǎng)細(xì)胞創新能力。

　　水凝膠制備：根據(jù)需要加入一定量的細(xì)胞培養(yǎng)基溶解凍干粉，如加入5ml培養(yǎng)基範圍，使用平頭移液槍頭輕輕吹打至凍干粉充分分散求得平衡，然后轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，渦旋30-60秒至完q溶解空間廣闊。隨后4000轉(zhuǎn)離心5分鐘除去氣泡領先水平。

　　細(xì)胞接種：將混合溶液加入沉淀的待培養(yǎng)細(xì)胞中重懸細(xì)胞，并調(diào)整到所需細(xì)胞濃度雙重提升，對(duì)于類器官培養(yǎng)戰略布局，推薦細(xì)胞密度為5×10?到1×10?左右。將得到的混合懸液接種到無TC處理的細(xì)胞培養(yǎng)板表現明顯更佳。

　　培養(yǎng)與換液：將培養(yǎng)板放入37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)狀態。換液時(shí)可采用回收重懸換液或半量換液兩種方式技術節能。回收重懸換液即吸取培養(yǎng)體系廣泛認同，加入緩沖液或培養(yǎng)基稀釋10倍國際要求，混勻后1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，沉淀回收細(xì)胞鍛造，再用同樣支架濃度的培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后加入培養(yǎng)容器重要部署。半量換液則是取出一半體積的培養(yǎng)體系，加入另一培養(yǎng)孔工具，再用同樣支架濃度的培養(yǎng)液補(bǔ)滿并吹打混勻智慧與合力。

　　細(xì)胞回收：吸取培養(yǎng)體系置于無菌離心管內(nèi)堅持先行，加入緩沖液或培養(yǎng)基稀釋10倍提供了有力支撐，混勻后1500轉(zhuǎn)離心5分鐘綠色化，即可沉淀回收細(xì)胞新格局。